Protein Diggers или Где добывают белОк биохимики, из серии "один мой день"

Итак, до перерыва но обед мы оставили в холодильнике уже наполовину очищенную смесь белков. Однако остаться должен только один! Засунем-ка смесь в хроматограф и посмотрим, что получится. Наберём наш образец в шприц и аккуратно введём во внутреннюю камеру хроматографа.

Потом нажмём на кнопку "старт" и будем нервно курить в углу с нетерпением ждать результата!

Как же отделить различные молекулы друг от друга? Существуют различные способы. Каждый белок по-своему уникален, имеет определённый размер, заряд и свойства поверхности. Именно эти качества и будут использоваться для разделения смеси. Чаще всего используется последовательно несколько этапов очистки, например, сначала по размеру, потом по заряду.

Вспомним Золушку. Как-то раз ей выдали мешок разных круп и велели отобрать оттуда только что-то одно. Если бы Золушка имела технический склад ума, она придумала бы использовать для этого сито. А ещё лучше несколько сит последовательно с ячейками разного размера. Так, сначала можно было бы отобрать только самое маленькое, например, пшено, потом что-то побольше, например, чечевицу, а потом еще побольше, например горох, фасоль. Для разделения белков биохимики выдумали так называемое "молекулярное сито" - материал, имеющий поры очень-очень маленького размера. Хитрость молекулярного сита ещё и в том, что оно трёхмерное. Полый цилиндр заполнен микроскопическими бусинами, а в бусинах сквозные дырочки. Система работает так: большие молекулы не влазят в дырочки в бусинах, поэтому быстро проваливаются вниз между бусинами, их ничто не задерживает. Маленькие молекулы пролазят в дырочки в бусинах и застревают там, им требуется значительно больше времени, чтобы достигнуть выхода. Жидкость, выходящую из цилиндра, специально обученный мини-робот сразу раскапывает по пробиркам. Так как большие и маленькие молекулы покинут цилиндр в различное время, они в результате окажутся в разных пробирках. Нам останется просто взять нужную пробирку, содержащую интересующий нас продукт. Вот так мы и разделили молекулы по размеру. Вуаля! (нет, я не знаю, почему на штативе написано L'Oreal, я вовсе не там работаю).

Разделение молекул заняло около 4 часов. После такого разделения порой получается очень много пробирок на выходе. Примерно вот столько:

Если присмотреться, то заметно, что 3 и 4 пробирки немного другого цвета, чем все остальные. Забегая вперёд, могу сказать, что там и окажется интересующий нас продукт. Окрашен, правда не он, а какое-то сопутсвующее ему соединение, от которого мы будем избавляться в дальнейшем.

Но пока что ещё мы ничего такого не знаем, мы только предполагаем, где примерно может оказаться наш продукт, потому что в хроматографе есть встроенный детектор, который просвечивает протекающую по нему жидкость ультрафиолетом и "видит", присутствует ли в ней что-то или нет. Однако, детектор может дать только ответ да/нет, но он не знает, что именно присутствует в каждой пробирке. Поэтому нам надо теперь взять по капельке из каждой пробирки для анализа. Таким образом мы увидим, в какой пробирке сидит желаемый нами белок.


Вы устали, и я устала. Уже дело к ночи. Поэтому я не показываю всю процедуру анализа, которая занимает около 2х часов, и не показываю, как я параллельно ещё с другим белком работала, а показываю только результат. Вот у меня в руке прозрачная пластинка. Между двумя кусочками стекла в ней находится тонкая пластинка геля. Гель - это такая плотная субстанция, по консистенции похожая на расплющенного желатинового мишку. 2 часа назад мы нанесли образцы белка, взятые из пробирок, на верхнюю часть геля, а потом подали напряжение. Поскольку белки - молекулы заряженные, в электрическом поле деваться им некуда, приходится бежать от "минуса" к "плюсу" (существует некоторая хитрость, чтобы все дружно бежали именно к "плюсу", а не в разных направлениях). Но поскольку белки ещё и размера разного, то маленькие бегут быстрее больших и толстых (совсем как люди . В результате опять получается разделение молекул по заряду/массе.

Пластинку геля мы достанем из стёкол, положим в лоханку и покрасим синеньким красителем.

Затем отмоем краситель. Этот краситель необратимо связывается с белками, поэтому там, где бежали белки, останутся синенькие полоски, а весь остальной гель снова станет бесцветным.
В общем, толстенькие синие полоски означают наличие белка в пробирке. Моя щаслив! Мы трепетно соберём эти пробирки, содержащие раствор белка, и после некоторых манипуляций заморозим их содержимое в жидком азоте и будем хранить как зеницу ока в той самой морозильной камере на -80°C.

Напоследок покажу, как определяют концентрацию белка, пользуясь тем же самым синеньким красителем (чем синее, тем белка больше), ибо красиво!

Тем временем мой "винтажный" телефон сообщает, что уже без пятнадцати одиннадцать вечера, и надо потихоньку сворачиваться. С этим телефоном у меня прямо кармическая связь какая-то, я его и терять пыталась, и роняла сто раз, но он всегда ко мне возвращался, служит верой и правдой вот уже 8 лет и ничего ему не делается.

Спасибо всем, кто дочитал до этого места и не очумел

У меня все. Всем спасибо за внимание